项目介绍
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学研究、疾病诊断、基因表达分析等领域的高灵敏度、定量化的检测技术。该平台通过实时监测PCR反应中荧光信号的变化，实现对目标DNA或RNA的精确定量。
qPCR平台的核心原理是在PCR反应过程中，随着每一个扩增周期的进行，荧光信号不断增强。通过特定的荧光染料或探针与PCR产物结合，在PCR反应进行的同时，荧光信号被实时检测并记录。与传统PCR不同，qPCR不需要在反应结束后进行凝胶电泳分析，而是通过实时采集数据，实现了高效、快速、自动化的结果分析。
总体来说，实时荧光定量PCR技术凭借其高灵敏度、高特异性、定量精确等优势，已成为现代生物学研究和临床应用中不可或缺的重要工具。
功能介绍
实时荧光定量PCR（qPCR）测试是一种强大的分子生物学技术，能够实现对目标DNA或RNA的定量分析。其功能涵盖了多个方面，广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、病原检测等领域。以下是qPCR测试的主要功能介绍：
基因表达定量分析：qPCR能够精准测量特定基因的表达水平，通过对不同样本间基因表达的比较，揭示基因在不同生理状态下的变化。这对于癌症研究、免疫反应、药物反应等方面的研究尤为重要。
病原检测与定量：qPCR广泛应用于病原检测，如病毒、细菌和真菌的定量分析。例如，可以实时监测病毒载量，如HIV、流感病毒或新型冠状病毒，帮助进行临床诊断和疾病监控。
突变检测与基因多态性分析：qPCR可用于检测DNA中的特定突变或多态性，常用于遗传疾病的诊断和筛查，帮助评估疾病风险并支持个性化医疗。
拷贝数变异分析：qPCR可以检测基因组中的拷贝数变异（CNVs），通过对目标基因的拷贝数进行定量，评估与疾病相关的基因扩增或缺失现象。
实时监测PCR反应：qPCR通过实时采集荧光信号，能够精确监测PCR反应的进程，帮助研究人员实时评估扩增效果，确保实验的高效性和准确性。
高通量筛选：qPCR平台支持多重检测，能够在单一反应中同时检测多个目标基因，提高检测效率，并减少实验操作时间。
临床诊断与监控：qPCR技术已广泛应用于临床诊断领域，尤其是在传染病检测（如病毒载量监测）、肿瘤标志物检测以及药物疗效评估等方面具有不可替代的作用。
定量分析：通过与标准曲线的比较，qPCR能够精确计算目标基因的初始拷贝数，提供高精度的定量结果。这一功能使得qPCR不仅可以确认目标是否存在，还能精准判断其丰度。
综上所述，实时荧光定量PCR（qPCR）测试以其高灵敏度、特异性及定量能力，广泛应用于基础研究、临床诊断以及公共卫生监测等多个领域，是现代分子生物学和临床医学中不可或缺的重要工具。
项目案例
样品要求
实时荧光定量PCR（qPCR）是一项高度敏感的技术，要求样品在提取、处理及储存过程中保持高质量，以确保实验结果的准确性和可靠性。以下是qPCR的样品要求：
样品类型：
DNA样品：可以是基因组DNA、质粒DNA等。通常用于基因定量分析、突变检测等。
RNA样品：用于基因表达分析。必须进行逆转录，转换为cDNA后进行qPCR检测。RNA样品需要严格避免降解。
血液、组织、细胞培养物、体液等：qPCR适用于各种生物样品，但不同类型的样品需要不同的处理方法。
样品纯度：
DNA纯度：样品中的DNA应当是高纯度的，A260/A280比值应在1.7至2.0之间。过高或过低的比值可能意味着样品中含有蛋白质或其他污染物，影响PCR反应。
RNA纯度：RNA样品的A260/A280比值应为1.8至2.0，A260/A230比值应接近2.0，低于该值可能指示有其他污染物（如酚或盐）的存在。
样品浓度：
DNA样品浓度：推荐浓度通常为50–250 ng/μL，过高或过低的浓度都会影响PCR反应的效率和特异性。
RNA样品浓度：通常要求在50–1000 ng/μL范围内，过低的浓度可能导致逆转录效率差，而过高的浓度可能导致反应抑制。
样品完整性：
DNA完整性：使用的DNA应保持完整，避免降解。可通过电泳检测其完整性，确保没有明显的降解带。
RNA完整性：RNA样品的完整性应通过凝胶电泳或Bioanalyzer等工具进行检查。理想的RNA应呈现明显的28S和18S rRNA带，且无明显降解。
无污染：
样品中应避免含有PCR抑制剂（如盐分、酚、酒精等），这些物质可能干扰PCR反应。
RNA样品特别容易受到RNase污染，因此样品需要在无RNA酶的环境中处理，并使用无RNA酶的设备。
样品处理与储存：
DNA样品：应储存在-20°C或更低温度下，避免反复冻融。
RNA样品：应迅速存储在-80°C，避免反复冻融以防止降解。若需要长时间储存，RNA样品应使用含有RNA保护剂的溶液。
在提取过程中，所有设备和试剂需无RNA酶或DNA酶污染。
逆转录与引物设计（针对RNA样品）：
若为RNA样品，需使用高质量的逆转录试剂和合适的引物。逆转录反应中的RNA量需要足够以获得有效的cDNA产物。
使用的引物应设计为特异性强，避免与基因组DNA结合，以减少背景信号。
引物和探针的选择：
引物和探针应针对目标基因的特定区域设计，确保其特异性和高效性。设计时需要避免二级结构和引物二聚体的形成。
总结而言，实时荧光定量PCR样品的质量是确保实验成功的关键，必须严格遵循相关要求，以提高数据的准确性和重复性。
